BACTÉRIAS GRAM

Introdução:

O Método de GRAM

A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações histológicas para observação ao microscópio óptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composição química e integridade da sua parede celular. Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista obteve com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este método o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importância ao seu método de coloração. Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

Na técnica de Gram, colora-se bactérias com um corante violeta especial. A bactéria que assim obtiver uma cor roxa, será gram positiva e a que obtiver coloração rósea, gram negativa. A gram positiva ganha coloração roxa porque sua camada mais externa, a parede celular, formada por peptidoglicano, absorve a tinta. Já a gram negativa é rósea porque, apesar de também ter parede celular, esta fica abaixo de uma membrana adicional, parecida com a mebrana plasmática, típica deste grupo de bactérias, logo não ocorrendo absorção.

Procedimento:

Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de violeta-de-metila e deixe agir por 15 segundos;
Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a lâmina. Deixe agir por mais 45 segundos;
Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de água corrente. Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 segundos;
Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente;
Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 segundos;
Lave a lâmina em um filete de água;
Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre;
Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico com objetiva de imersão (100 X).

Resultado:

Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante violeta-

de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do mordente (Soluto de Lugol), ocorre à formação do complexo iodo-pararosanilina, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas coradas.

Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com ácool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem completamente. O corante safranina colore novamente as estruturas que foram descoradas.

As bactérias Gram-positivas, que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano – peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante, permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (roxo). Já as bactérias Gram-negativas com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas), perdem o complexo iodo-pararosanilina, são incapazes de reter o violeta de Genciana, assumindo a cor do corante de fundo (vermelha).

São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, principalmente com relação à espessura da camada de peptidoglicano, que é responsável pelo diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.

Este critério de identificação auxilia, o tratamento a estes agentes etiológicos (as bactérias), visto que as Gram-negativas são mais tolerantes e as Gram-positivas são mais sensíveis a antibióticos (penicilina).

2.0. As diferenças entre bactérias GRAM Positivas e GRAM Negativas

A parede da célula da gram-negativa é constituída por estruturas de múltiplas camadas bastante complexas, que não retêm o corante quando submetidas a solventes nos quais o corante é solúvel, sendo descoloradas e, quando acrescentados outros corantes, adquirem a nova coloração. Já a parede da célula gram-positiva consiste de única camada que retém o corante aplicado, não adquirindo a coloração do segundo corante.
Nas bactérias gram-negativas, a parede celular está composta por uma camada de peptidioglicano e três outros componentes que a envolvem externamente: lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo.
Entretanto, as paredes celulares das bactérias gram-positivas e gram-negativas são diferentes. A parede celular da bactéria gram-positiva é espessa, de 10 a 50 mícron, chegando até a 80 mícrons e a da gram-negativa é menos espessa, com 7,5 a 10 mícrons. A membrana citoplasmática adere fortemente ao componente interno da célula bacteriana. A parede celular da bactéria gram-positiva é única e consiste de uma camada espessa, composta quase que completamente por peptidioglicano, responsável pela manutenção da célula e sua rigidez. As múltiplas camadas de peptidioglicano (15 a 50 mícrons) das bactérias gram-positivas constituem uma estrutura extremamente forte em tensão, enquanto nas gram-negativas o peptidioglicano é apenas uma camada espessa e, conseqüentemente, frágil.
Como fatores de ataque ou agressão, as células gram-positivas e gram-negativas caracterizam-se por graus diferentes de virulência. As bactérias gram-negativas são constituídas por uma endotoxina, o LPS, que lhes confere a propriedade de patogenicidade, enquanto nas bactérias gram-positivas a exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico, tem como característica principal a aderência.

Como característica específica da célula bacteriana, ao se comparar com a célula humana, observa-se a parede celular que, em conjunto com a membrana citoplasmática, forma o envelope celular das bactérias.
O envelope celular das bactérias gram-negativas quimicamente consiste de 20 a 25% de fosfolipídios e 45 a 50% de proteínas, sendo os 30% restantes de uma lipoproteína, o lipopolissacarídeo.

3.0. Microscopia óptica: